|
|
Identification and characterization of flagellar tip proteins in Trypanosoma brucei
Pavlisková, Hana ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Čajánek, Lukáš (oponent) ; Hashimi, Hassan (oponent)
Distální konec eukaryotického bičíku je jednou z nejdůležitějších částí bičíku v mnoha eukaryotických buňkách. S distálním koncem bylo asociováno několik důležitých funkcí, avšak jeho proteinové složení zůstává záhadou. Hlavním cílem této dizertační práce je identifikovat a charakterizovat proteiny distálního konce eukaryotického bičíku. Využitím modelového organismu, Trypanosoma brucei, který je známý jako parazit, a TrypTag.org projektu, který má za cíl lokalizovat všechny protein-kódující geny v genomu tohoto modelového organismu, se nám podařilo identifikovat 78 proteinů, které lokalizují na distální konec bičíku T. brucei. Abychom mohli tyto kandidátní proteiny charakterizovat, bylo nutné zavést v naší laboratoři nové přístupy. Za prvé jsme vyvinuli protilátkové markery, které označují distální konec nově vznikajícího bičíku, přesněji konektor spojující bičíky. Za druhé jsme vyvinuli rychlý přístup bez klonování pro značení a inducibilní overexpresi trypanozomálních proteinů. Prokázali jsme, že tento přístup je vhodný jak pro overexpresi velkých proteinů, tak i proteinů distálního konce bičíku. To umožňuje studium fenotypů při overexpresi proteinů a generuje materiál pro purifikaci proteinů pro následnou biochemickou charakterizaci. Za třetí jsme optimalizovali ultra-expanzní mikroskopii,...
|
|
|
Vývoj nových izotopově značených sond pro relativní kvantifikaci proteinů
Procházková, Valérie ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Vaňková, Pavla (oponent)
Objasnění struktury proteinů v živých organismech je důležitým krokem pro popis jejich úlohy v organismu. Jednou z metod strukturní biologie je chemické zesítění v kombinaci s hmotnostní spektrometrií, která je běžně používaným nástrojem pro charakterizaci terciální struktury proteinů nebo protein-proteinových interakcí. Tato metoda je založena na reakci síťovacího činidla, složeného ze dvou reaktivních skupin propojených raménkem o definované délce za vzniku kovalentní vazby. Hlavním cílem této práce bylo ověřit, zda je možné využít chemické zesítění v kombinaci s izotopově značenými činidly ke kvantifikaci dvou odlišných strukturních stavů. V práci byla využita činidla DSPU (disukcinimidyldipropionát močovina) a izotopově značená forma DSPUx. Činidla DSPU i DSPUx obsahují ve své struktuře labilní molekulu močoviny, která je při kolizně indukované disociaci štěpena na charakteristické fragmenty, díky kterým lze identifikovat zesítěné peptidy. Přístupy shora dolů a zdola nahoru bylo na vybraných proteinech (insulin, lidská karbonická anhydrasa a hovězí sérový albumin) zjištěno, že činidla DSPU a DSPUx interagují s vybranými peptidy a proteiny a jsou vhodná pro jejich kvantifikaci. Na modelu myoglobinu byly následně sledovány strukturní rozdíly v jeho dvou konformačních stavech, v přítomnosti hemu...
|
|
|
Jaderné receptory v regulaci genové exprese, vývoje a metabolismu Caenorhabditis elegans.
Yilma, Petr ; Kostrouch, Zdeněk (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
4 Abstrakt Genetické regulační mechanismy genové exprese podmiňují správný vývoj, funkci a odpověď na potřeby organismu ve vztahu k proměnlivým životním podmínkám. Jsou však relativně pomalé. Životní procesy vyžadující rychlou odpověď na změny prostředí a metabolismu jsou z velké části prováděny na úrovni proteinů, především jejich posttranslačních modifikací a protein-proteinových interakcí. Cílem experimetnální práce spojené s touto disertací bylo využití modelového systému Caenorhabditis elegans ke studiu regulace genové exprese transkripčními faktory ze skupiny jaderných receptorů. Modelový systém C. elegans nabízí velmi výkonné experimetnální přístupy především v oblasti genetiky, genomiky a funkční fenotypické analýzy. V práci spojené s touto disertací jsem studoval regulaci genové exprese za experimantálních podmínek z hlediska funkční proteomiky a zaměřil jsem se na využití separačních metod a metod pokročilé proteomiky, především hmotnostní spektrometrie. V první části práce jsem charakterizoval jaderný receptor NHR-60 na úrovni proteinu. Tento jaderný receptor je exprimován ve dvou proteinových formách o velikosti 50 kDa a 64 kDa, které jsou s různou intensitou detekovány v materiálu z kultur C. elegans a to přes to, že na úrovni mRNA je nhr-60 exprimován ve formě jediné mRNA odpovídající proteinu...
|
|
| |
host ::
RSS.